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花青素還原酶（ANR）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法

產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱(chēng)：Anthocyanin Reductase (ANR) Activity Assay Kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC4095
規(guī)格：100T/48S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：5600
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：花青素還原酶|花青素還原酶活性檢測(cè)|ANR|ANR活性檢測(cè)
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。臨用前搖晃均勻。
試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×2支，4℃保存。每支臨用前加入1mL蒸餾水備用。
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入1mL乙醇和1mL蒸餾水混勻溶解備用。可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑四：液體1mL×1支，4℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：
花青素還原酶（ANR）是原花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，使花色素轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的順式黃烷-3-醇，在植物體內(nèi)起著非常重要的調(diào)控作用。
ANR在NADPH作用下將氯化矢車(chē)菊素轉(zhuǎn)化為黃烷-3-醇和NADP，在340nm下測(cè)定NADPH的減少速率，即可反映ANR活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、乙醇、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、樣本處理：
（1）組織：稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心15分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。
（2）細(xì)胞或微生物樣品的制備：先收集細(xì)胞或微生物樣品到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬(wàn)細(xì)胞或微生物加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。12000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
（1）紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至340nm。蒸餾水調(diào)零。
（2）加樣表：
試劑名稱(chēng)（μL）      測(cè)定管       對(duì)照管
試劑一                170          170
試劑二                10            10
試劑三                 5             5
樣品                   10            -
上述試劑混勻后37℃水浴反應(yīng)30min。
試劑四                  5            5
樣品                    -            10
混勻后測(cè)量測(cè)定管和對(duì)照管在340nm下的吸光度，分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管，計(jì)算ΔA=A對(duì)照管-A測(cè)定管。

三、ANR活力計(jì)算：
1、按微量石英比色皿計(jì)算：
（1） 按蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADPH的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
ANR（U/mg prot）=[ΔA÷(ε×d)×109×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T =107.18×ΔA÷Cpr。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADPH的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
ANR（U/g 鮮重）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反總]÷(W÷V提取×V樣)÷T =107.18×ΔA÷W。
（3） 按細(xì)胞或微生物個(gè)數(shù)計(jì)算：
單位的定義：每104個(gè)細(xì)胞或微生物在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADPH的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
ANR（U/104 cell）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反總]÷(500÷V提取×V樣)÷T =0.2144×ΔA。

V反總：反應(yīng)總體積，2×10-4L；
ε：NADPH的摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V樣：加入的樣品體積，0.01mL；
Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；
W：樣品質(zhì)量，g；
V提取：提取液體積，1mL；
500：500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；
T：反應(yīng)時(shí)間，30min。
2、按96孔UV板計(jì)算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：
1、當(dāng)ΔA大于0.4或者A對(duì)照管大于1（96孔UV板為ΔA大于0.2或者A對(duì)照管大于1）時(shí)，建議將反應(yīng)混合液用試劑一稀釋更大倍數(shù)或者減少加入的樣品體積進(jìn)行測(cè)定；ΔA過(guò)小時(shí)，可以增加酶促反應(yīng)時(shí)間（45min或60min）或增加加入的樣品體積來(lái)測(cè)定。
2、加入試劑四后，請(qǐng)?jiān)?5min內(nèi)測(cè)定完成。
3、樣品蛋白濃度另行測(cè)定。