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莽草酸脫氫酶（SD）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
英文名稱：Valeric acid dehydrogenase (SD) activity detection kit
關(guān)鍵詞：莽草酸脫氫酶|莽草酸脫氫酶活性檢測|SD|SD活性檢測
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
貨號：BC4180
規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存，用前搖勻。
試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 10mL 蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×2 瓶，4℃避光保存。臨用前每瓶加入 11mL 蒸餾水溶解。

產(chǎn)品說明：
莽草酸途徑是存在于植物和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代謝途徑中催化第四步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。
莽草酸脫氫酶催化莽草酸和 NADP 產(chǎn)生 NADPH，檢測 340nm 下的吸光值增加速率來表示 SD 活性。

試驗中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提?。?/span>
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液（加入前搖勻））進行冰浴勻漿，然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
液體：直接檢測。

二、測定步驟：
1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制：按照試劑一：試劑二：試劑三為 7:4:8 的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。用前25℃預(yù)熱 15min。
3、 操作表：在 1mL 石英比色皿中分別加入下列試劑：
試劑名稱     空白管   測定管
工作液（μL）   950      950
樣本（μL）               50
蒸餾水（μL）    50

加入樣本即開始計時，充分混勻后于 340nm 處測定 20s 時的吸光值 A1 和 5min20s 時的吸光值A2，計算△A 測定管= A2 測定-A1 測定，△A 空白管=A2 空白-A1 空白，△A=△A 測定管-△A 空白管。
空白管只需做一次。

三、SD 酶活計算：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
SD 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×Crp）÷T= 643×△A÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每克樣品每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
SD 酶活（U/g 鮮重）=△ A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T = 643×△A÷W
（3）按照細胞數(shù)量計算
酶活定義：每 104個細胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
SD 酶活（U/104
cell）=△ A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量（萬個））÷T
= 643×△A÷細胞數(shù)量（萬個）
（4）按液體體積計算
酶活定義：每 mL 樣本每分鐘每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
SD 酶活（U/mL）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷V 樣÷T= 643×△A

ε：NADPH 微摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3L；
V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；
Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g，
T：反應(yīng)時間：5min。

注意事項：
1、 樣本提取上清液置于冰上待測，且樣本提取完成后建議 2h 內(nèi)測完。
2、 樣品的蛋白濃度需自行測定，由于提取液中含有較高的蛋白濃度（約 10mg/mL），所以測定樣品蛋白濃度時需扣除提取液自身蛋白濃度。
3、 △A 大于 1 時，建議將樣品稀釋后再進行測定。當(dāng)△A 小于 0.01 時，可以延長反應(yīng)時間（10min或 15min）來測定。
4、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過 0.01。